seq的优点和局限,染色质免疫沉淀法

ChIP-seq或染色质免疫沉淀和测序是一种技术,允许研究人员通过在全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用和表观遗传标记来理解转录调控。与以前的方法相比,ChIP-seq具有几个优点,例如ChIP芯片,但与所有技术一样,ChIP-seq也有其局限性。

核心提示:染色质免疫沉淀法(Chromatin
immunoprecitation,ChIP)是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与染色质免疫沉淀法(Chromatin
immunoprecitation,ChIP)是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况,还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说,组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能,因此,ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用,全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。

图片 1

该技术主要应用于:1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”2.转录调控分析3.药物开发研究4.有丝分裂研究5.DNA损失与凋亡分析真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的,所有信号传递途径的终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质,染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制–“组蛋白密码”,其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定,组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:如组氨酸乙酰转移酶可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶可以去除氨基酸上的乙酰基团;组蛋白甲基转移酶可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可以用来改变染色质结构。染色质免疫沉淀分析是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白,是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。凝胶电泳迁移率改变分析是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法,但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点,这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。染色质免疫沉淀分析是基于体内分析发展起来的方法,它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白,是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。ChIP基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完成一个染色质免疫沉淀分析。

ChIP-seq

ChIP-seq是下一代测序的首批应用之一,该测序是在2000年代中期开发的。其前体ChIP芯片通过与微阵列杂交分析片段,显示DNA-蛋白质相互作用。使用下一代测序的ChIP-seq可以直接测序目标片段,而不是将它们杂交在阵列上。简而言之,ChIP-seq涉及用甲醛处理细胞以在体内将结合蛋白与DNA交联。然后使用超声处理将染色质剪切成200-600bp范围内的较小片段。对靶蛋白特异的抗体用于免疫沉淀DNA-蛋白质复合物。最后一步涉及逆转交联和DNA的释放,其在任何下一代平台上测序以鉴定蛋白质结合的序列。

ChIP-seq的优点

与ChIP芯片相比,ChIP-seq技术可实现单碱基对的分辨率,更少的伪像,更好的覆盖范围和更大的动态范围。优异的碱基对分辨率是最重要的优势之一,因为阵列在杂交过程中具有基本的不确定性,这限制了分辨率。虽然ChIP芯片的分辨率因阵列而异,但通常在30-100bp范围内,但ChIP-seq具有单核苷酸分辨率。绕过杂交过程对ChIP-seq有额外的好处。在ChIP芯片的杂交过程中,不完全匹配的序列之间可能存在交叉杂交,这增加了信号噪声。由于直接测序方法,ChIP-seq本质上不受这些噪声源的影响。但是,可以使用ChIP-seq接收一些GC偏差。与其他方法相比,ChIP-seq提高了分辨率。阵列的强度信号可能不完全是线性的,并且阵列的动态范围限制在饱和点之外。这导致它们在ChIP芯片中被遮挡,但不是ChIP-seq实验。与ChIP芯片的检测下限相反,ChIP-seq没有有限的动态范围。下一代测序技术意味着基因组覆盖不限于固定在阵列上的探针序列。重复基因组区域,如异染色质或微卫星,通常在阵列上被掩盖,但可以使用ChIP-seq进行有效分析。ChIP-seq在样品数量方面比ChIP芯片更具优势,因为ChIP-seq需要更少的量。ChIP-seq产生更精确的蛋白质结合位点列表和转录因子,增强子和序列基序的鉴定。可以使用ChIP-seq分析染色质和组蛋白变体的核小体定位和翻译后修饰。这种分析尤其受益于增强的空间分辨率。

ChIP-seq的局限性

ChIP-seq的主要限制是访问和成本。研究人员可以通过开发自己的构建库的协议来降低成本,但总体价格必须进一步降低,以与其他方法相媲美。ChIP芯片技术每个阵列的成本约为400-800美元,而ChIP-seq的成本为每通道1,000-2,000美元(对于一个这样的下一代平台)。因为ChIP-seq在免疫沉淀中使用抗体,所以数据的质量依赖于抗体的质量。几种市售抗体的质量差异很大,不仅在供应商之间,而且在批次之间。可以验证抗体质量,但是这样的过程是费力且耗时的。需要将ChIP-seq产生的谱中的峰与对照样品中的相同基因座进行比较,以确定峰的显着性。这通常在免疫沉淀之前用DNA进行,处理DNA但缺乏抗体,并且使用不具有DNA结合或染色质修饰参与的抗体。这使科学家能够克服可能已经引入的各种伪影,但目前尚未就哪种控制最合适达成共识,这三种方法的一致性可能不同。

相关文章

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注